ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul  bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya  dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Pemberian aliran listrik dapat menyebabkan terjadi perpindahan aliran elektron dan zat objek, kemudian akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.

Metoda Elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal.

Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Gel agarosa dapat melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul  DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya.

Elektroforesis adalah metode pemisahan atau analisis fisika berdasarkan migrasi partikel bemuatan yang terlarut atau terdispersi dalam larutan elektrolit dengan bantuan medan listrik, terdapat fase diam yaitu kertas dan fase gerak yaitu partikel bermuatan yang terlarut di antaranya adalah ion kompleks 90Ydan 90Sr. Akibat diberi beda potensial, fase gerak akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu ke arah elektroda yang sesuai. Pemisahanterjadi akibat ketidak homogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran, dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif. Faktor-faktor yang menyebabkan kegagalan elektroforesis gel agarosa antara lain karena sel belum lisis sempurna, DNA belum keluar dari sel, serta DNA mengalami degradasi (tekanan mekanik).

Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan. 

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya (Martin, 1996).

DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan. Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel (Der Lee, 2011).

Fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

·         Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik.

·     Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.

·        Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.

·     UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.

·         Aquades sebagai pelarut

·         Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa

·         TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH

·         Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram

·      EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA

·         Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa

·         Tangki elektroforesis untuk running DNA

·         Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

·         Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

·         Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

            Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan berikut:

1.    Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom.

2.    DNA fingerprinting.

3.    Mendeteksi kelainan genetik.

4.    Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.

5.    Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen.

6.    Mempelajari evolusi tingkat molecular.

7.    Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.

8.    Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.

9.    Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.

10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid.

11.Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.

            Menurut Susanto (2012), laju migrasi DNA ditentukan oleh konformasi molekulnya, dari yang paling cepat yaitu Covalently Closed Circular (CCC), Open Circular, dan linier. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya.

           Agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan pustaka, teknik elektroforesis pada dasarnya didasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan membentuk gelatin yang padat.

by. Ana Diana Solich - yakin usaha sampai

DAFTAR REFERENSI

Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering, 2011, 4, 523-528.

Fairbanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. 4th ed. Wadsworth Publishing Company, London: xix + 820 hlm.

Lawrence, E. 1989. Henderson’s dictionary of biological terms. 10th ed. John Will & Sons, New York.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford.

Ripani, M. 2010. Diagnostik Molekuler. Teknologi Laboratorium Kesehatan (TLK) di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Schleif, R. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Inc., Belmont.

Sulaiman, Adang Hardi G, Noor Anis Kundari. 2007. Pemisahan dan Karakterisasi Spesi Senyawa Kompleks YTRIUM-90 DAN STRONSIUM-90 dengan elektroforesis kertas. JFN, Vol.1 No.2. Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka – BATAN.

Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto

Yepyhardi. 2009. Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular. http://sciencebiotech.net .