ANALISIS URUTAN BASA DNA

Istilah bioinformatics mulai dikemukakan pada pertengahan era 1980-an. Bioinformatika  mengacu pada penerapan komputer dalam biologi. Namun demikian, penerapan bidang-bidang dalam bioinformatika (seperti pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk analisis sekuens biologis) sudah dilakukan sejak tahun 1960-an (Attwood, T.K., Kajian baru Bioinformatika ini tak lepas dari perkembangan biologi molekul modern yang ditandai dengan kemampuan manusia untuk memahami genom, yaitu cetak biru informasi genetik yang menentukan sifat setiap makhluk hidup yang disandi dalam bentuk pita molekul DNA. Kemampuan untuk memahami dan memanipulasi kode genetik DNA ini sangat didukung oleh TI melalui perangkat perangkat keras maupun lunak. Bioteknologi modern ditandai dengan kemampuan pada manipulasi DNA. Rantai/sekuen DNA yang mengkode protein disebut gen. Gen ditranskripsikan menjadi mRNA, kemudian mRNA ditranslasikan menjadi protein yang disebut sentral dogma dalam biologi molekuler. Protein bertugas menunjang seluruh proses kehidupan, antara lain sebagai katalis reaksi biokimia dalam tubuh, berperan serta dalam sistem pertahanan tubuh melawan virus, parasit dan lain-lain.

Kelahiran bioinformatika modern tak lepas dari perkembangan bioteknologi di era tahun 70-an, dimana seorang ilmuwan AS melakukan inovasi dalam mengembangkan teknologi DNA rekombinan. Berkat penemuan ini lahirlah perusahaan bioteknologi pertama di dunia, yaitu Genentech di AS, yang kemudian memproduksi protein hormone insulin dalam bakteri, yang dibutuhkan penderita diabetes. Selama ini insulin hanya bisa didapatkan dalam jumlah sangat terbatas dari organ pankreas sapi.

Bioinformatika, sesuai dengan asal katanya yaitu "bio" dan "informatika", adalah gabungan antara ilmu biologi dan ilmu teknik informasi (TI). Pada umumnya, Bioinformatika didefenisikan sebagai aplikasi dari alat komputasi dan analisa untuk menangkap dan menginterpretasikan data‐data biologi. Ilmu ini merupakan ilmu baru yang yang merangkup berbagai disiplin ilmu termasuk ilmu komputer, matematika dan fisika, biologi, dan ilmu kedokteran, dimana kesemuanya saling menunjang dan saling bermanfaat satu sama lainnya. Ilmu bioinformatika lahir atas insiatif para ahli ilmu komputer berdasarkan artificial intelligence. Mereka berpikir bahwa semua gejala yang ada dialam ini bisa dibuat secara artificial melalui simulasi dari gejala‐gejala tersebut. Untuk mewujudkan hal ini diperlukan data‐data yang yang menjadi kunci penentu tindak‐tanduk gejala alam tersebut, yaitu gen yang meliputi DNA atau RNA. Bioinformatika ini penting untuk manajemen data‐data dari dunia biologi dan kedokteran modern. Perangkat utama bioinformatika adalah program software dan didukung oleh kesediaan internet.

Kebutuhan untuk mengumpulkan, menyimpan dan menganalisa data-data biologis dari database DNA, RNA maupun protein inilah yang semakin memacu perkembangan kajian bioinformatika, bahkan dari urutan DNA maupun asam amino yang ada, dapat diprediksikan peran proteinnya, tingkat aktivitas dan mekanisme kerjanya menggunakan berbagai jenis perangkat lunak yang tersedi. Selain itu, dengan bioinformatik perancangan primer untuk mendeteksi keberadaan suatu gen dari spesies tertentu dapat dilakukan. 

Bioinformatika adalah organisasi dan analisis komplek data yang dihasilkan dari analisa molekuler dan teknik biokimia, disamping itu bioinformatika merupakan teknologi untuk koleksi, peyimpanan analisis, interprestasi, pelepasan dan aplikasi untuk informasi biologi. Analisis dilakukan dengan cara membandingkan data yang masuk dengan ribuan data lain yang tersedia di dalam pangkalan data. Suatu urutan DNA ataupun asam amino dari hasil sekuensing dapat diketahui kemiripannya dengan urutan yang tersimpan dalam data base melalui teknik bioinformatik. Bahkan dari urutan DNA maupun asam amino yang ada, dapat diprediksikan peran proteinnya, tingkat aktivitas dan mekanisme kerjanya menggunakan berbagai jenis perangkat lunak yang tersedia. Selain itu, dengan bioinformatik perancang primer untuk mendeteksi keberadaan suatu gen dari spesies tertentu dapat dilakukan (Nuswantara, 2000).

Bioinformatika juga menerjemahkan penemuan ke klinik dengan menyebarkan penemuan melalui curated, database dicari seperti Pharm GKB, dbGaP, PacDB dan FDAAERS.  Sebuah hambatan utama bagi database ini adalah kurasi manual data. Secara biologis dan secara medis fokus pada teks penambahan algoritma yang dapat mempercepat koleksi data terstruktur, seperti metode yang menggunakan sintaks kalimat dan pengolahan bahasa alami untuk mendapatkan obat-gen dan gen-gen interaksi dari literatur ilmiah. Database dan metode ini perlu dikembangkan dan digunakan dengan hati-hati. Semua sumber-sumber data yang rentan terhadap kesalahan dan sehingga validasi data sangat penting, terutama sebelum informasi tersebut diterapkan di klinik (Fernald et al, 2011).

Beberapa contoh kegunaan Bioinformatika :

1. Bioinformatika dalam Bidang Klinis

Aplikasi Informatika ini berbentuk data-data mengenai informasi klinis dari seorang pasien seperti data analisa diagnosa laboratorium, hasil konsultasi dan saran, foto rontgen, ukuran detak jantung, dan lain lain.

2. Bioinformatika untuk Identifikasi Agent Penyakit Baru

            Aplikasi ini digunakan untuk mendeteksi kemungkinan penyakit baru yang akan muncul baik melalui virus ataupun media yang lainnya.

3. Bioinformatika untuk Diagnosa Penyakit Baru

            Aplikasi ini digunakan untuk mendiagnosa penyakit apa yang diderita oleh pasien dan untuk mengetahui obat apa yang tepat dan perawatan yang akan diberikan kepada pasien.

4. Bioinformatika untuk Penemuan Obat

Aplikasi ini digunakan untuk menemukan terobosan pada obat dengan kombinasi berbagai macam senyawa seperti enzim, asam amino dan lain-lain.

Praktikum kali ini yaitu menggunakan program online BLAST dan NEBcutter untuk analisis urutan basa DNA. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan suatu alat pencari yang dapat menyesuaikan dan mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu singkat. Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu:

1.      Nucleotide blast (blastn): membandingkan suatu sekuen nukleotida yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida.

2.      Protein blast (blastp): membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki dengan database sekuen protein.

3.      Blastx: membandingkan produk translasi konsep 6-frame sebuah sekuen nukleotida (translated nucleotide) yang kita miliki dengan database sekuen protein.

4.      Tblastn: membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame.

5.      Tblastx: membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida.

NEBcutter adalah sebuah alat untuk menentukan enzim restriksi yang memotong urutan DNA tertentu; urutan dapat diberikan oleh pengguna sebagai file teks, file FASTA, atau nomor GenBank. GenBank basis data sekuens adalah akses terbuka, beranotasi koleksi semua yang tersedia secara umum nukleotida urutan dan mereka protein terjemahan. Database ini diproduksi dan dipelihara oleh National Center for Biotechnology Information (NCBI) sebagai bagian dari International Nukleotida Sequence Database Kolaborasi (INSDC). The National Center for Biotechnologi Information merupakan bagian dari National Institute of Health di Amerika Serikat. GenBank dan kolaborator yang menerima urutan diproduksi di laboratorium di seluruh dunia dari lebih dari 100.000 organisme yang berbeda. GenBank terus tumbuh pada tingkat eksponensial, dua kali lipat setiap 18 bulan. Release 155, diproduksi pada bulan Agustus 2006, berisi lebih dari 65 miliar basa nukleotida di lebih dari 61 juta urutan. GenBank dibangun oleh pengajuan langsung dari laboratorium individu, maupun dari kiriman curah dari pusat sequencing skala besar.

Penyejajaran sekuens (sequence alignment) adalah proses penyusunan/pengaturan dua atau lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens tersebut tampak nyata. Hasil dari proses tersebut juga disebut sebagai sequence alignment atau alignment saja. Baris sekuens dalam suatu alignment diberi sisipan (umumnya dengan tanda "–") sedemikian rupa sehingga kolom-kolomnya memuat karakter yang identik atau sama di antara sekuens-sekuens tersebut. Berikut adalah contoh alignment DNA dari dua sekuens pendek DNA yang berbeda, "ccatcaac" dan "caatgggcaac" (tanda "|" menunjukkan kecocokan atau match di antara kedua sekuens).

ccat---caac

| ||   ||||

caatgggcaac

Sequence alignment merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam alignment diasosiasikan dengan proses mutasi, sedangkan kesenjangan (gap, tanda "–") diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Sequence alignment memberikan hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens tersebut. Misalnya, kedua sekuens dalam contoh alignment di atas bisa jadi berevolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Dalam kaitannya dengan hal ini, alignment juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut bisa jadi penting bagi struktur atau fungsi protein tersebut (Rega, 2011).

Selain itu, sequence alignment juga digunakan untuk mencari sekuens yang mirip atau sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik dalam penyusunan alignment. Beberapa metode alignment lain yang merupakan pendahulu BLAST adalah metode "Needleman-Wunsch" dan "Smith-Waterman". Metode Needleman-Wunsch digunakan untuk menyusun alignment global di antara dua atau lebih sekuens, yaitu alignment atas keseluruhan panjang sekuens tersebut. Metode Smith-Waterman menghasilkan alignment lokal, yaitu alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua metode tersebut menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya efektif untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment).

Fungsi-fungsi software yang digunakan sebagai berikut :

1.      BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) berfungsi mencari program database urutan biologis. Program ini menggunakan algoritma BLAST untuk membandingkan antara DNA sekuens protein untuk query database.

2.      NEBcutter merupakan program untuk memetakan situs restriksi. Sekuen DNA dapat dimasukkan dengan beberapa cara: (1) Upload dari file yang sudah ada, (2) Memasukkan Accession Number jika input berasal dari data GenBank, (3) Memasukkan sekuen DNA ke kotak yang disediakan, atau (4) Memilih sekuen standar yang ada di database NEBCutter. Kemudian dapat diatur beberapa parameter jika ada yang perlu diubah, dan hasilnya akan tampil.

Program online lain yang dapat digunakan dalam analisis urutan basa DNA adalah PRIMER3. PRIMER3 merupakan program untuk perancangan primer. Primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerisasi DNA secara in vitro, karena tanpa primer, reaksi polimerisasi DNA tidak akan terjadi meskipun enzim dan komponen lainnya sudah tersedia. Selain itu primer juga berfungsi untuk membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada reaksi PCR. Tahap-tahap dalam merancang primer denagn mentukan tujuan, menyiapkan sekuens referensi, dan bisa di desain dengan batuan software. Perancangan primer menggunakan software PRIMER 3 dengan memeprhatikan parameter untuk masing-masing primer sebagai berikut.

1. Panjang Primer

Secara umum disepakati bahwa panjang primer PCR yang optimal adalah 18-22 bp. Panjang ini cukup panjang untuk mencapai spesifisitas yang cukup, dan cukup pendek bagi primer untuk terikat dengan mudah pada DNA template pada suhu annealing-nya.

2. Suhu Leleh Primer

Suhu leleh atau melting temperature (Tm) adalah temperatur dimana setengah dari duplex DNA akan terpisah menjadi utas tunggal dan Tm juga mengindikasikan stabilitas duplex. Hasil terbaik biasanya diperoleh jika primer memiliki Tm 52-58 °C. Primer dengan nilai Tm di atas 65 °C memiliki kecenderungan untuk terjadinya annealing sekunder. Nilai Tm bisa diindikasikan dari GC content dan dapat dihitung secara akurat menggunakan rumus-rumus tertentu.

3. Suhu Annealing Primer (Ta)                 

Nilai Temperatur Leleh (Tm) merupakan estimasi stabilitas hibrid DNA-DNA dan penting untuk menentukan suhu annealing. Jika Ta terlalu tinggi maka akan menyebabkan hibridisasi primer-template yang kurang baik sehingga yield produk PCR pun akan rendah. Sebaliknya jika Ta terlalu rendah maka bisa menyebabkan banyaknya produk-produk non-spesifik karena akan terjadi banyak mismatch yang menurunkan spesifisitas PCR.

Clustal juga merupakan program bioinformatika untuk alignment multipel (multiple alignment), yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama Clustal adalah ClustalW dan ClustalX. Metode lain yang dapat diterapkan untuk alignment sekuens adalah metode yang berhubungan dengan Hidden Markov Model ("Model Markov Tersembunyi", HMM). HMM merupakan model statistika yang mulanya digunakan dalam ilmu komputer untuk mengenali pembicaraan manusia (speech recognition). Selain digunakan untuk alignment, HMM juga digunakan dalam metode-metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi daerah pengkode protein dalam genom dan prediksi struktur sekunder protein.

Enzim restriksi endonuklease mampu melakukan pemotongan pada sekuen yang mirip tetapi tidak identik dengan daerah spesifik pemotongannya. Hilangnya fidelity atau meningkatnya pemotongan pada daerah yang mirip dengan daerah pengenalan resmi (canonical). Enzim restriksi umum dikenal dengan istilah Star Activity, yaitu perubahan pengenalan pada spesifitas enzim restriksi endonuklease yang diperantarai oleh pembelahan DNA yang terjadi akibat perlakuan pada kondisi yang sangat berbeda dari kondisi optimum enzim bekerja. Biasanya hasil yang didapat adalah pemotongan pada sisi pengenalan selain sisi pengenalan spesifik, atau terkadang kehilangan spesifitasnya sama sekali. Dengan meningkatnya star activity maka umumnya akan menurunkan aktivitas pemotongan pada daerah resmi. Misalkan untuk EcoR I, perbedaan laju antara daerah resmi dengan daerah star mendekati nol bersama dengan meningkatnya konsentrasi etilen glikol lebih dari 4M dan pada EcoR V, perbedaan laju turun menjadi hanya enam kali ketika Mg++ digantikan dengan Mn++. 

Beberapa jenis enzim restriksi endonuklease mempunyai sifat star activity, diantaranya: Apo I, Ase I, BamH I, BssH II, EcoR I, EcoR V, Hind III, Hinf I, Pst I, Pvu II, Sal I, Sca I, Taq I, Xmn I, dll. Cara perubahan spesifitas enzim tergantung dari enzim itu sendiri dan juga kondisi yang akan memicu terjadinya star activity. Tipe perubahan spesifitas yang paling sering dijumpai adalah substitusi basa tunggal, pemotongan dari basa terluar pada sekuen pengenalan, dan torehan (nicking) pada untai tunggal. Menunjukan bahwa pada kondisi pH yang dinaikkan dan daya ionic yang rendah, EcoR I akan memotong sekuen N/AATTN, sedangkan pada penelitian yang dilakukan Gardner menunjukan bahwa EcoR I* (EcoR I star activity) memotong pada sisi mana saja yang berbeda dari sekuen pengenalan yang resmi (canonical sequences) dengan cara subtitusi basa tunggal, subtitusi ini tidak terjadi pada (A) menjadi (T) atau (T) menjadi (A), perubahan ini terjadi pada bagian sentral dari sekuen tetranukleotida (AATT).

Contoh enzim retriksi salah satunya adalah enzim AlwI yang merupakan enzim jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs seperti FokI. Enzim ini memotong di luar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2 domain khusus. Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang satunya untuk memotong DNA.

Kelebihan dan kekurangan Bioteknologi modern antara lain:

õ  perbaikan sifat genetik dapat dilakukan secara sangat terarah

õ  dapat mengatasi kendala ketidaksesuaian genetik

õ  dapat memeperpendek jangka waktu pengembangan galur tanaman baru

õ  relatif mahal dan memerlukan kecanggihan teknologi

õ  pengaruh jangka panjang belum diketahui

by. Ana Diana Solich - yakin usaha sampai

Referensi :

• Attwood, T.K., dan D.J. Parry-Smith. 1999. Introduction to Bioinformatics. Harlow: Pearson Education. ISBN 0-582-32788-1
• Krane, D.E., dan M.L. Raymer. 2003. Fundamental Concepts of Bioinformatics. San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-8053-4633-3
• Mount, D.W. 2001. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-608-7
• dan dari berbagai sumber.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul  bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya  dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Pemberian aliran listrik dapat menyebabkan terjadi perpindahan aliran elektron dan zat objek, kemudian akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.

Metoda Elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal.

Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Gel agarosa dapat melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul  DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya.

Elektroforesis adalah metode pemisahan atau analisis fisika berdasarkan migrasi partikel bemuatan yang terlarut atau terdispersi dalam larutan elektrolit dengan bantuan medan listrik, terdapat fase diam yaitu kertas dan fase gerak yaitu partikel bermuatan yang terlarut di antaranya adalah ion kompleks 90Ydan 90Sr. Akibat diberi beda potensial, fase gerak akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu ke arah elektroda yang sesuai. Pemisahanterjadi akibat ketidak homogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran, dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif. Faktor-faktor yang menyebabkan kegagalan elektroforesis gel agarosa antara lain karena sel belum lisis sempurna, DNA belum keluar dari sel, serta DNA mengalami degradasi (tekanan mekanik).

Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan sarung tangan. 

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya (Martin, 1996).

DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan. Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel (Der Lee, 2011).

Fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

·         Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik.

·     Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.

·        Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.

·     UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.

·         Aquades sebagai pelarut

·         Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa

·         TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH

·         Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram

·      EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA

·         Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa

·         Tangki elektroforesis untuk running DNA

·         Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

·         Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

·         Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

            Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan berikut:

1.    Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom.

2.    DNA fingerprinting.

3.    Mendeteksi kelainan genetik.

4.    Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.

5.    Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen.

6.    Mempelajari evolusi tingkat molecular.

7.    Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.

8.    Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.

9.    Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.

10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid.

11.Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.

            Menurut Susanto (2012), laju migrasi DNA ditentukan oleh konformasi molekulnya, dari yang paling cepat yaitu Covalently Closed Circular (CCC), Open Circular, dan linier. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya.

           Agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan pustaka, teknik elektroforesis pada dasarnya didasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan membentuk gelatin yang padat.

by. Ana Diana Solich - yakin usaha sampai

DAFTAR REFERENSI

Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering, 2011, 4, 523-528.

Fairbanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. 4th ed. Wadsworth Publishing Company, London: xix + 820 hlm.

Lawrence, E. 1989. Henderson’s dictionary of biological terms. 10th ed. John Will & Sons, New York.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford.

Ripani, M. 2010. Diagnostik Molekuler. Teknologi Laboratorium Kesehatan (TLK) di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Schleif, R. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Inc., Belmont.

Sulaiman, Adang Hardi G, Noor Anis Kundari. 2007. Pemisahan dan Karakterisasi Spesi Senyawa Kompleks YTRIUM-90 DAN STRONSIUM-90 dengan elektroforesis kertas. JFN, Vol.1 No.2. Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka – BATAN.

Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto

Yepyhardi. 2009. Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular. http://sciencebiotech.net .

ISOLASI DNA

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju, terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA.

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom (Susanto, 2012).

DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, mitikondria, dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat.

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA  adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 ̊C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

Tahap-tahap isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer non osmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang, biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus (Susanto, 2012).

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Susanto, 2012).

Semakin rendah kadar air dalam buah maka semakin tinggi hasil presipitasi DNA, dan sebaliknya jika buah yang memiliki kadar air tinggi makan nantinya akan menghasilkan presipitasi DNA yang rendah.

Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda, dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Perolehan plasmid harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda.

Salah satu prinsisp isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatannya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul. Hasil elektroforesis DNA total akan menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid.

Sebuah isolasi yang baik harus sederhana, cepat dan efisien serta menghasilkan jumlah DNA yang cukup berkualitas tinggi yang cocok untuk analisis molekuler. Hasil DNA dari protokol yang dioptimalkan diamati secara luas bebas dari polyphenolik dan metabolit sekunder, sebagaimana ditentukan oleh digesti yang sukses dengan restriksi endonuklease dan amplifikasi PCR. Semua metode tersebut pada umumnya menggunakan detergen seperti SDS untuk melisiskan dinding sel, dan sering menghambat manipulasi pemurnian lebih lanjut (Alatar, et al, 2012).

DAFTAR REFERENSI

Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The Isolation Of  PCR-Amplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research 11 (1): 348-354. 

Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Erlangga, Jakarta. 

Goodenough, ursula. 1988. Genetics. Erlangga, Jakarta.

http://wanenoor.blogspot.com.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Biologi FMIPA UM, Malang.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Program Sarjana Biologi, Malang.

Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda, Bogor

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik  Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Bogor.

Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.