ISOLASI DNA

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju, terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA.

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom (Susanto, 2012).

DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, mitikondria, dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat.

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA  adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 ̊C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

Tahap-tahap isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer non osmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang, biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus (Susanto, 2012).

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Susanto, 2012).

Semakin rendah kadar air dalam buah maka semakin tinggi hasil presipitasi DNA, dan sebaliknya jika buah yang memiliki kadar air tinggi makan nantinya akan menghasilkan presipitasi DNA yang rendah.

Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda, dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Perolehan plasmid harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda.

Salah satu prinsisp isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatannya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul. Hasil elektroforesis DNA total akan menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid.

Sebuah isolasi yang baik harus sederhana, cepat dan efisien serta menghasilkan jumlah DNA yang cukup berkualitas tinggi yang cocok untuk analisis molekuler. Hasil DNA dari protokol yang dioptimalkan diamati secara luas bebas dari polyphenolik dan metabolit sekunder, sebagaimana ditentukan oleh digesti yang sukses dengan restriksi endonuklease dan amplifikasi PCR. Semua metode tersebut pada umumnya menggunakan detergen seperti SDS untuk melisiskan dinding sel, dan sering menghambat manipulasi pemurnian lebih lanjut (Alatar, et al, 2012).

DAFTAR REFERENSI

Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The Isolation Of  PCR-Amplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research 11 (1): 348-354. 

Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Erlangga, Jakarta. 

Goodenough, ursula. 1988. Genetics. Erlangga, Jakarta.

http://wanenoor.blogspot.com.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Biologi FMIPA UM, Malang.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Program Sarjana Biologi, Malang.

Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda, Bogor

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik  Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Bogor.

Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.